镇江香醋有机酸组成及乳酸合成的生物强化

【摘要】镇江香醋是中国传统发酵食醋的典型代表，其特有的“分层发酵”多菌种混合酿造工艺赋予了镇江香醋良好的风味和独特的口感。镇江香醋中除主体酸——乙酸外，还富含其它有机酸，使得镇江香醋相比于其它食醋而言具有柔和的“酸而不涩”口感。长期以来，对于镇江香醋的风味物质研究较为粗浅，其中包括有机酸的组成、量比关系以及对风味的贡献度等，因而原有的镇江香醋的“地理标志产品”的国家标准中仅以总酸等较为单一的指标来表征产品品质，导致市场上造假售假严重，严重制约了镇江香醋的健康发展。本论文针对我国传统发酵食醋的特征，优化了其有机酸的分析方法，对比分析了不同地域的发酵食醋有机酸组成，明确了镇江香醋有机酸组成特征及其对产品风味的影响；采用微生物纯培养技术从醋醅中分离获得具有高产乳酸特性的微生物，并研究了其发酵代谢特征；将乳酸菌用于镇江香醋醋酸强化发酵，在保证镇江香醋产品风味特色的基础上有效提高镇江香醋中乳酸的相对含量。本论文的主要研究结果如下：优化了食醋有机酸组成分析的样品预处理方法，结果表明，亚铁氰化钾-硫酸锌法可有效地沉淀食醋样品中的生物大分子物质，Sep-PakC18固相萃取小柱可有效的去除样品中色素等小分子杂质。优化了发酵食醋中9种有机酸的HPLC定量分析方法，最优色谱条件为：以C18色谱柱进行分离，流动相为NaH2PO4溶液，流速为0.9mLmin-1，检测波长为210nm，整个分析在14min内完成。从应用情况来看，该方法具有灵敏、准确、稳定等优点，可用于发酵食醋中有机酸的HPLC定量分析，目前该法已被新修订的《镇江香醋（GB/T18623-2011）》国家标准采用，成为我国食醋有机酸的标准检测方法。采用优化后的有机酸分析方法，对我国7个不同地域（镇江、北京、福建、山西、上海、广东、浙江）生产的50种食醋有机酸组成进行了分析。结果表明，固态发酵食醋、液态发酵食醋和配制食醋中，乙酸占可检测的总有机酸的平均比例分别为58.1%，79.2%和97.4%，乳酸占比分别为28.8%，16.6%和0.1%，传统固态发酵食醋的乳酸相对含量明显高于液态食醋及配制食醋。乳酸和乙酸为发酵食醋的主体有机酸，两者的相对含量占样品总有机酸含量的80%以上。其中，柠檬酸、焦谷氨酸可以作为镇江香醋的特征有机酸用来区分其它6个地域的食醋产品。对镇江地区13个厂家生产的22种镇江香醋产品的有机酸组成分析结果表明，不同产品的有机酸组成存在一定的差别。对22种镇江香醋产品进行感官评价，发现其感官评价得分与有机酸含量无显著相关性，因此不能直接通过有机酸含量来确定不同有机酸对镇江香醋产品风味的影响。在可检测的9种有机酸中，乙酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸和焦谷氨酸的风味强度最高，是影响镇江香醋口感的重要有机酸。考虑到柠檬酸成本较低、易人为添加，故在新修订的《镇江香醋（GB/T18623-2011）》国家标准中将“乙酸、乳酸、琥珀酸和焦谷氨酸”这四种有机酸定义为镇江香醋的特征有机酸，并规定“其中乙酸含量不高于上述四种有机酸总含量的65%，乳酸含量不低于上述有机酸总含量的10%”。进一步对同一批次酿造的镇江香醋进行感官评价，发现在总酸为4.5-5.5g100mL-1时，镇江香醋产品的风味品质与总酸呈现正相关。在4.5g100mL-1至5.5g100mL-1的总酸范围内，镇江香醋产品中乙酸相对含量的升高会降低产品风味品质，而乳酸相对含量的适当提高有利于提升镇江香醋产品风味品质。另外，对不同季节生产的镇江香醋醋醅卤汁中乳酸、乙酸、琥珀酸、焦谷氨酸的相对含量进行分析，发现冬季生产的食醋乳酸相对含量显著低于夏季生产的食醋。采用产酸微生物分离平板，从镇江香醋正常醋酸发酵过程的醋醅中分离出具有产酸能力的微生物，以醋酸菌、乳酸菌和芽孢杆菌为主，其中乳酸菌发酵合成乳酸的能力显著高于醋酸菌和芽孢杆菌。对镇江香醋醋醅中乳酸菌的多样性研究结果表明，分离并鉴定获得的30株具有不同表型和生理生化特性的乳酸菌属（Lactobacillus）菌株分属于7个不同的种。以乙醇作为碳源摇瓶模拟发酵结果表明，菌株LactobacillushelveticusM3-1具有高产乳酸的特性，发酵液中乳酸含量为701.2mg100mL-1。另外，该菌株具有代谢生成甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸的特点；同时，具有较好的代谢合成3-羟基丁酸乙酯（6.6μg100mL-1）、2-甲基丁酸（11.3μg100mL-1）等食醋风味化合物的能力。采用液态发酵培养的L.helveticusM3-1在镇江香醋醋酸发酵初始时进行强化接种。结果表明，L.helveticusM3-1的强化可以有效提高乳酸菌在醋醅微生物菌群中的相对丰度，从而增加醋醅产生乳酸等有机酸的能力。强化后的食醋产品中乳酸相对含量提高了3.4%，但强化前后乙酸的相对含量并无显著变化；感官评价表明，L.helveticusM3-1的强化未对镇江香醋产品的香气评分产生影响，但提高了食醋产品的滋味评分。因此，L.helveticusM3-1的强化能够在保持镇江香醋氨基酸等典型风味物质的含量的前提下，有效缩短醋酸发酵周期、提高乳酸相对含量、提升食醋滋味评分。
【作者】余永建；
【导师】许正宏；
【作者基本信息】江南大学，发酵工程，2014，博士
【关键词】镇江香醋；有机酸；乳酸；微生物；生物强化；

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